环特生物|国际研究|斑马鱼与小鼠肿瘤模型比较有哪些优势？

核心摘要

在精准肿瘤学中，预测临床相关肿瘤疾病（如治疗副反应和耐药性的出现）有两种主要策略：基于患者样本的基因组学、转录组学、表观基因组学或蛋白质组学分析的推断，以及个性化癌症化身的表型分析。长期以来，此类科研工作基本依赖于体内小鼠异种移植和体外类器官构建或细胞培养。

快速组合遗传模型的新进展发现，一种用先天免疫低下的斑马鱼研究人类肿瘤异种移植的新技术开发，以及首次利用斑马鱼幼鱼异种移植进行药物反应表型检测的临床试验，使这种微小的脊椎动物走到了研究的前沿精准医疗“竞技场”。在这篇文章中，讨论了转基因和基于移植的斑马鱼癌症模型如何与小鼠异种移植和人类类器官进行比较和补充，并概述了这些不同模型为预测研究提供的独特优势以及它们在未来临床应用中面临的当前挑战。

文｜Maurizio Fazio , Julien Ablain, Yan Chuan, David M. Langenau  and Leonard I. Zon

翻译丨张伟浩

文章原标题：《Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy》

发表于《Nature Reviews |CANCER》volume 20 | May 2020 | 263

（本文在翻译中做了部分节选）

一、斑马鱼和小鼠转基因模型

不同的癌症化身在生物学和逻辑上具有不同的优势和局限性，这使得它们的使用更适合于临床前药物开发或个性化药物测试。在一般的转基因癌症模型中，限制其在精确肿瘤学中应用的关键因素是模型构建所需的时间和用于近似基因组癌症复杂性的组合遗传学的规模。关于斑马鱼、小鼠和类器官癌症模型的比较，见下图表1：

克隆和DNA合成方法的新进展表明，斑马鱼转基因载体可以在1-2周内产生。在斑马鱼体内建立转基因嵌合肿瘤模型所需的时间从10天到8周不等，比如人类KRAS G12D驱动的横纹肌肉瘤，小鼠Myc驱动的T-ALL，NRAS Q61K驱动的黑色素瘤或黑色素瘤，源于成年BRAF V600E中靶向rb1（编码视网膜母细胞瘤1）的CRISPR载体的局部皮肤电穿孔tp53−斑马鱼。其他转基因模型可能需要数月才能形成，例如肉瘤模型（例如，由CMV启动子控制的PAX3–FOXO1易位驱动的横纹肌肉瘤在19个月时有16%的外显率）（图2）。

图2如下：

为了模拟基因组的复杂性，已经成功地实现了三到四个基因组事件的组合，并有可能进一步扩大到10-20个改变，这取决于混合载体转基因方法的局限性。从单个载体表达gRNAs阵列的策略可能进一步扩大CRISPR敲除策略的限制。

斑马鱼花叶病毒转基因模型的组合遗传学的速度和可扩展性远远超过了大多数基因工程小鼠模型，因为它们不需要进行多代杂交。利用流体动力注射（肝癌）或病毒载体（肺癌）在体内镶嵌转基因传递质粒DNA的少量小鼠模型在肿瘤发病时间和组合遗传学方面与斑马鱼模型具有相似的能力。

然而，小鼠维护、生物安全、病媒生产和处理方面的挑战和成本，对产生足够数量的动物来测试多种治疗剂构成了更大的障碍。相比之下，在生物安全级别1的条件下，一个操作员一天可以进行几千次斑马鱼胚胎显微注射，只需使用皮克到纳克的质粒DNA就可以生成基因临床患者的模型。

此外，饲养空间要求和成本虽然因国家和机构而异，但斑马鱼至少比老鼠低一个数量级。

转基因斑马鱼肿瘤模型目前仍然是有用的工具，用于基因型分层靶向治疗的临床前药物开发，以及测序研究中确定的遗传事件的表型解剖（例如，确定耐药的遗传驱动因素，基因作用的功能验证或克服抗性的新组合治疗的鉴定）。

同样重要的是要注意到，斑马鱼和小鼠转基因模型的遗传异质性有限，通常不能重现在患者身上看到的致瘤事件的顺序，并且对亚克隆结构的建模能力有限。因此，肿瘤内异质性的建模仍然是一个主要的挑战，并且仍然是这些模型预测患者药物反应的障碍。

二、PDXs和人类类器官：

使用病人来源的肿瘤材料进行经验性药物试验的方法受到以下几个因素的限制：

（1）在受体动物模型中体外培养或成功植入体内病人来源的癌细胞的能力；

（2） 从活组织检查或手术切除中获得的可用于体外培养或体内异种移植的有限数量的细胞；

（3）活组织检查和分析读数之间的时间；

（4）这些模型保持肿瘤异质性和克隆进化在患者体内表现的保真度，以及肿瘤微环境和与患者免疫系统的协同进化。

据报道，将患者来源的癌细胞异种移植到斑马鱼体内在概念验证研究中取得了高度的成功，无论是在从特定患者成功建立zPDX方面，还是在受体斑马鱼中显示出从特定供体植入的比例方面。

Fior等人在一项针对结直肠癌患者（n=5）的小型临床研究中报告了100%的供体植入，其中47-89%的斑马鱼幼鱼受体（n=47-251）显示了植入。作为一项联合临床试验进行的临床研究的初步部分结果，包括24名胰腺癌（n=12）、结肠癌（n=8）或胃癌（n=4）的成年患者，同样表明所有供体均植入，受体斑马鱼幼鱼的存活率相当。

其他研究报道在胃癌、腺样囊性癌和胰腺癌的PDXs幼鱼中成功植入。同样，来自黑色素瘤（n=2）、乳腺癌（n=1）、胶质瘤（n=1）或胚胎性横纹肌肉瘤（n=2）患者的6个PDX在37°C下异种移植在prkdc−/−、il2rga−/−敲除的成年斑马鱼中。结果表明，所有6个供体的植入后有35–80%的受体动物移植成功。

其次，每个接受者使用的细胞数量既是一个限制，也是一个优势。病人的病理组织是有限的，而且常常是不可再生的资源，尤其是来自活检或小肿瘤切除的材料。因此，类器官或斑马鱼移植幼鱼是有利的，因为它只需要约100个细胞每尾。因此，即使是少量的病人来源的细胞也可以有效地用于测试许多条件、药物、给药方案或药物组合。另一方面，成年斑马鱼或小鼠的异种移植分别需要100000或100000–1000000个细胞。

第三，基于类器官的药物检测需要1-2周，幼鱼体内的zPDX需要4-7天，成年斑马鱼和小鼠的PDX需要数周甚至数月才能读出。另一方面，成年斑马鱼和小鼠异种移植物中细胞数量较多，时间窗较长，这使得我们能够观察克隆进化和适应的影响过程，并对其进行建模，这对下文进一步讨论的耐药性预测具有意义。

一些基于移植的模型固有的局限性在老鼠和斑马鱼PDX之间很常见。小鼠研究强调了移植瓶颈和受体动物的进化如何改变患者表现或导致患者和小鼠模型之间不一致的进化模式。Krivtsov及其同事在分析基因驱动等位基因频率时报告了白血病小鼠PDX中50%的克隆不一致性，Golub及其同事展示了大量PDX在24种癌症类型中的小鼠特异性肿瘤进化。另一方面，在短期的体外培养过程中，人类类器官似乎保持了患者来源物质的遗传代表性。大规模的比较研究将需要确定遗传和转录异质性在成年zPDX化身中随时间而保留的程度。

虽然由于该领域的年轻化，临床预测研究在频率和规模上受到限制，但一些概念验证研究的结果令人鼓舞。菲奥埃特al.测试FOLFOX化疗和西妥昔单抗对5种结直肠癌PDX在斑马鱼幼鱼中的反应。zPDXs与FOLFOX（5名患者中的4名）和西妥昔单抗（3名患者中的3名）的实际患者临床反应结果一致。

虽然这些数字显然很小，但作为比较，迄今为止一项关于人类类器官对治疗反应的预测价值的前瞻性临床研究纳入了61名结直肠癌患者，并报告从患者组织建立体外培养的成功率为63%，61例患者中只有29例（47%）有可评价的反应，预测率为80%。因此，这项研究强调了药物反应的表型测试的前景和挑战，即使是在比斑马鱼化身更成熟的技术中。

除了癌细胞固有的异质性外，越来越多的证据表明，局部TME中存在的其他细胞类型在调节治疗反应中的重要性。与小鼠PDX非常相似，斑马鱼异种移植中局部TME成分的贡献是有限的，基于移植的斑马鱼化身不能捕获宿主-系统效应，如免疫协同进化和系统内分泌调节（表1）。所有移植为基础但更广泛的患者来源肿瘤模型的这种结构限制限制了所有这些分析在预测药物敏感性方面的预测能力。

三、总结：

进展表明类器官在模拟临床肿瘤行为方面具有保真度，首次报道类器官作为患者预后预测因子的前瞻性临床试验为药物应答表型检测的临床价值提供了概念证明。

然而，同样的前瞻性研究强调了这些体外工具的预测能力仍然很有限。同样，自从2011年提出以来，由于后勤方面的挑战，使用PDX的小鼠联合临床试验除了概念验证外几乎没有进展。斑马鱼癌症化身在规模、成本和模型开发速度以及自动化潜力方面比现有的活体模型具有独特的优势。

就个性化的转基因化身而言，时间障碍（测序、数据分析和载体生成的时间为1-4周，加上肿瘤潜伏期的时间为数周到数月）限制了它们为临床决策提供信息的益处。因此，它们仍然是有用的临床前模型，以解开癌症遗传学和药物发现。

随着成本的不断降低，DNA测序和合成的速度和采用率的不断提高，加上基因组工程技术的不断改进，应该能够产生更快速、更复杂的转基因斑马鱼模型，用于分析个别患者可能的治疗反应。这些研究将有助于精确的癌症医学，既可以直接影响特定患者的模型，也可以增加我们对癌症基因组学的更广泛的理解。通过从功能上评估特定突变对药物反应调节的影响，他们还应该提高我们根据推断模型来制定反应预测的能力，分析从不同类型的组学分析中观察到的肿瘤活检样本的变化。

另一方面，现在斑马鱼异种移植细胞的技术已经成熟，并且已经为幼鱼和成鱼zPDX的产生提供了强有力的概念验证研究，因此该领域走向临床部署并进行临床研究以评估其预测能力和价值至关重要为临床决策提供信息。

正在进行的试验旨在招募120名癌症患者，以评估幼鱼zPDXs的预测能力，这是一个很好的例子，并将为幼鱼zPDXs的整体价值提供有用的见解。目前还不清楚是否zPDXs在幼鱼中可以提供显着的优势相比，人类的类器官和头部研究将需要解决这个问题。这些幼鱼模型在以快速和短期反应为目标的临床环境中可能有价值，例如术前新辅助化疗。

除了药物反应预测之外，已经提出了用斑马鱼PDXs评估幼鱼的转移行为，但是还需要进一步的研究来评估发育中胚胎的迁移是否对人类癌症的转移风险或器官倾向性有帮助。

有证据表明，小鼠PDX和成年zPDX在生物学和预测方面具有相当的等效性，再加上斑马鱼模型较低的成本以及较高的药物筛选效率，将使其成为精确癌症治疗的有吸引力的替代品（表1）。

成本效益分析将指导表型药物检测多个领域的参与者在临床上取得进展。在生存结果和避免毒性反应方面对患者的潜在临床益处，同时能够避免无效治疗的浪费和控制管理的潜在风险和成本节约，是进一步开发个性化癌症模型的必然需求。

参考资料：

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