关于转基因斑马鱼癌症模型及斑马鱼肿瘤异种移植的研究

核心摘要

在精确肿瘤学中，预测临床相关肿瘤行为（如治疗反应和耐药性的出现）有两种主要策略：基于患者样本的基因组学、转录组学、表观基因组学和/或蛋白质组学分析的推断，以及个性化癌症化身的表型分析。一直以来，我们依赖于体内小鼠异种移植和体外类器官或2D细胞培养。

快速组合遗传模型的全新进展发现，一种用先天免疫低下的斑马鱼实验研究人类肿瘤异种移植的新技术开发，以及利用斑马鱼幼鱼异种移植进行药物反应表型检测的临床试验，使这种微小的脊椎动物走到了研究的前沿精准医疗竞技场。在这篇综述中，讨论了转基因和基于移植的斑马鱼癌症化身的进展。

文｜Maurizio Fazio , Julien Ablain, Yan Chuan, David M. Langenau  and Leonard I. Zon

翻译丨张伟浩

文章原标题：《Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy》

发表于《Nature Reviews |CANCER》volume 20 | May 2020 | 263

（本文在翻译中做了部分节选）

一、综述

生物医学界一直在开发越来越多的新型抗癌药物。在化疗是唯一可获得的系统性治疗的时代结束后，一系列新的靶向治疗以及近来的免疫治疗药物进入了临床开发或获得了监管批准。不断扩大的治疗方案为需要系统治疗的癌症患者带来了新希望，但也给肿瘤医生带来了新的挑战。给特定的病人开哪种药这个看似简单的问题越来越难以确定地解决。新药物的开发速度超过了需要进行的长期和复杂的试验，以确定哪种剂量、时间表和组合策略将为特定的患者群体带来临床效益。

精准肿瘤学领域诞生于解决这些问题的需要，即创建一种新的预后和治疗范式，专注于对单个患者(而非群体)进行优化治疗。从哲学上讲，精准医疗远离了基于群体平均水平比较的预测，而是关注患者独特的疾病特征。

具体来说，在精准肿瘤学中，这种新范式产生了两种主要方法：

基于对肿瘤活检样本的单个或多个组学（基因组学、转录组学、表观基因组学和蛋白质组学）分析来推断疾病行为，由于技术的改进，这种方法相对快速且廉价；第二种方法是利用从体外培养或异种移植的肿瘤活检样本中获得的个性化癌症化身，对肿瘤行为和药物反应进行功能测试。

作为一种临床预测工具，前一种方法受到以下因素的限制：我们对常见癌症驱动因素之外的基因中单个基因突变的功能后果的了解、事件组合的影响以及克隆动力学和肿瘤进化的复杂性，这些因素可能导致药物反应。

后一种方法通过模拟聚焦于肿瘤的表型行为和模拟可能的治疗设置来克服这种复杂性;然而，它受到特定模型的生物学保真度的限制，作为病人反应的代理，以及后勤方面的考虑——分析时间、成本和可伸缩性，以及测试多种条件的挑战。

药物反应的表型测试历来依赖于在体外培养的患者来源的癌细胞，如2D培养或3D类器官，或在体内培养的小鼠异种移植。转基因斑马鱼和移植斑马鱼癌症化身的全新技术进展，加上规模、成本、时间和条件的多重性等内在的物流优势，自动化的潜力将斑马鱼带入精确癌症治疗药物反应的表型测试领域。

在这篇综述中，我们重点介绍了工具的历史和进化，这些工具使得在斑马鱼中快速生成组合转基因癌症模型成为可能，以及37°C饲养的免疫缺陷斑马鱼的幼鱼和成体标本异种移植的发展。

二、稳定的转基因癌症模型：

由于与人类广泛保存器官特异性遗传程序和癌症相关基因，端粒生物学上与人类比小鼠更为相似，并且在单细胞阶段通过显微注射对胚胎进行基因操作相对容易，斑马鱼很快成为一种有希望在体内模拟癌症的生物体。

图1如下：

2003年，首次报道了斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病(T- ALL)基因工程癌症模型（图1）。将小鼠Myc非保守片段置于斑马鱼rag2启动子的控制下，该启动子限制对淋巴细胞的表达。当将其注射到野生型斑马鱼胚胎中时，5%的F0斑马鱼在1个月到5个月大之间发育出T-ALL。转基因的种系传递使外显率提高到100%，降低了肿瘤的潜伏期。

这个模型为斑马鱼的癌症建模提供了一个显著的概念证明，并为白血病发生机制的新发现奠定了基础。这项研究也为在斑马鱼身上开发其他肿瘤模型铺平了道路，包括2004年的胰腺神经内分泌肿瘤和2005年的黑色素瘤，从那时起，已经建立了许多其他的模型，包括使用Cre介导的重组的条件模型和化学诱导模型。

然而，在大多数人类癌症，特别是实体肿瘤中，肿瘤发生被认为需要多种基因驱动，包括致癌基因的激活和肿瘤抑制因子的缺失。因此，除了RAS驱动的模型外，仅基于致癌基因表达的斑马鱼模型普遍表现出较低的外显率，这在很大程度上限制了它们的使用。其他局限性包括许多模型是通过一种致癌基因的表达偶然获得的，而这种致癌基因并不总是反映人类肿瘤的早期克隆基因驱动因素。驱动癌基因表达的启动子的组织特异性的程度对于人类肿瘤发生的忠实再现也是至关重要的。

斑马鱼黑色素瘤模型使用了人类黑色素瘤中常见的驱动因子BRAFV600E，放置在黑色素细胞特异性斑马鱼mitfa启动子的控制下。

与人类一样，BRAF V600E在斑马鱼黑色素细胞中的表达只产生猪色素痣。然而，在斑马鱼体内注射携带tp53肿瘤抑制基因33失活突变的mitfa:BRAFV600E构建体（其人类同源基因在约15%的人类黑色素瘤中发生突变）在4个月内启动了6%斑马鱼恶性黑色素瘤的形成。这些肿瘤经组织学和表型分析证实为黑色素瘤。

重要的是，该病的外显率在稳定期达到近100%mitfa:BRAF V600E；tp53−F1转基因斑马鱼。这个mitfa:BRAF V600E；tp53−斑马鱼黑色素瘤模型随后成为多基因筛选的可靠基础，旨在在体内功能性探测人类黑色素瘤遗传学，并已鉴定出几种新的黑色素瘤调节剂。

虽然这种建模方法非常有价值，但也存在一些技术上的困难。首先，就像其他成熟的转基因斑马鱼癌症模型一样，维持含有多个转基因的稳定细胞系是困难的；其次，可以组合的转基因数量仍然有限，这使得测试复杂的遗传相互作用具有挑战性。第三，与人类癌基因的过表达不同，内源性斑马鱼肿瘤抑制基因的敲除是系统性的，而不是组织特异性的。大多数模型仍然是基于人类致癌基因的转基因表达，而不是内源性或同源斑马鱼位点的敲入，因此可能没有生理水平的表达。基因组编辑技术的全新进展已经并将有助于克服这些限制。

三、快速组合遗传建模：

CRISPR–Cas9系统为体内癌症建模创造了新的机会。它允许肿瘤抑制基因的快速镶嵌失活，绕过稳定的转基因系的需要。它还通过靶向不同基因的导向rna（gRNAs）的多重化大大增加了组合建模的潜力，使得对复杂的人类癌症基因型的重述和从人类癌症基因组学推断的假定遗传相互作用的体内评价成为可能。它促进了大规模的屏幕识别新的癌症驱动因素的目标。

  在老鼠身上，CRISPR使快速建立敲除斑马鱼系成为可能。利用Tol2转座子技术，该技术有助于将DNA结构插入斑马鱼基因组，CRISPR载体已被开发用于组织特异性基因失活，其方法是将斑马鱼U6启动子驱动的gRNA盒与置于组织限制性斑马鱼启动子控制下的cas9序列组装在一起。在胚胎组织如肌肉和红细胞中观察到有效的镶嵌基因敲除。

通过设计靶向斑马鱼肿瘤抑制基因的载体，并以黑素细胞特异性的方式表达人类肿瘤基因，我们能够通过将BRAF、NRAS或KIT中的致癌突变与cdkn2a、tp53、ptena或ptenb中的功能缺失突变相结合，快速而有力地模拟人类黑色素瘤中发现的所有主要基因型（图2）. 具侵袭性基因型的肿瘤在注射后3周(NRAS Q61R表达和tp53缺失)或在几个月内(BRAF V600E表达和cdkn2a缺失)就得到了，这与在人类疾病中的观察结果一致。

图2如下：

四、斑马鱼肿瘤异种移植：

斑马鱼作为移植接受者，斑马鱼有许多固有的特征使它成为理想的移植接受者。

首先，通过荧光标记移植细胞，可以很容易地追踪移植的正常或恶性细胞，并且使用光学透明的casper斑马鱼品系作为受体，可以直接观察移植物。

第二,斑马鱼是高度多产的,成熟的雌性每周能产生数以百计的鸡蛋,但是很小,所以成千上万的斑马鱼可以保存在一个设施,因此管理和维护成本相对较低的老鼠(虽然这可能国家和机构之间的显著差异,据报道,比率是数量级的成本约1.05美元每只老鼠和大约0.01美元每成年斑马鱼). 重要的是,可以在执行手动移植或显微镜下注射几百成年斑马鱼或者几千斑马鱼鱼仔,分别在一天内由一个操作符(图2 b),促进大——规模和高吞吐量细胞移植研究与免疫力低下小鼠模型是很难执行的。将非免疫匹配的斑马鱼细胞移植到部分免疫受损的成年斑马鱼体内已经成为常规。当与斑马鱼模型中可用的大规模遗传筛选和药物发现平台相结合时，这些研究为肿瘤内克隆进化和异质性、治疗耐药、侵袭和转移、造血和干细胞移植提供了有价值的见解。

（1）斑马鱼幼鱼的异种移植：

2006年至2007年，人们首次描述了将人类癌细胞系异种移植到斑马鱼幼鱼中的黑色素瘤。此后，大量研究报道了将癌细胞系异种移植到斑马鱼幼鱼中。然而，尤其早期的研究并不总是包括对异种移植存活和增殖的严格评估。十年后，三项概念证明研究发表了，它们在斑马鱼幼鱼中从血液恶性肿瘤和实体肿瘤中开发了患者来源的异种移植(PDXs)，随后其他研究显示了肿瘤细胞亚群之间的合作，可以协同促进肿瘤进展和药物反应的表型测试。

斑马鱼的适应性和先天免疫系统在小鼠和人类中高度保守。在斑马鱼中，先天免疫在受精后头一天开始发育，而适应性免疫在受精后2-3周左右在形态和功能上成熟。在早期幼体发育过程中，免疫缺陷期较短，这使异种移植的人类或小鼠细胞移植和短期存活，而不需要对斑马鱼进行免疫。通过这种方法，多种类型的细胞被移植到斑马鱼体内，得到了许多重要的发现，包括控制癌细胞分化、增殖和迁移的机制，以及治疗反应。一个特别的优点是野生型斑马鱼幼体在形成色素沉着之前具有天然的光学清晰度，这使得移植细胞的单细胞分辨率成像、分析和量化变得容易，这一特性优于其他移植模式生物。第三，大多数以幼鱼为受体的异种移植实验是在37℃以下进行的，在这些温度下，移植的人体细胞不会以相同的速度增殖，也不会形成类似于免疫缺陷的肿瘤块Nsg小鼠或人类患者。

 （2）成年斑马鱼的异种移植：

免疫缺陷斑马鱼模型是近来开发的移植异种患者来源的癌细胞到成年斑马鱼受体。以前在促进异种移植细胞在成年斑马鱼体内的长期移植和存活方面的尝试包括使用辐射或化学处理对动物的免疫系统进行短暂的消融。

γ辐照野生型或casper受体斑马鱼鱼允许稳定的移植肿瘤和造血的细胞移植后20天,因为因为照射后30天宿主免疫系统恢复,但还没有报道可能的人类细胞移植。类固醇药物地塞米松的长期化学诱导免疫抑制可使人体肿瘤的一部分移植时间超过时间点30天。由于地塞米松本身是临床上用于白血病和淋巴瘤的抗癌药物，这种方法不适合评估血液和白血病细胞移植。此外，化学免疫抑制引入了另一层实验变异性，并可能导致药物与被测试剂的相互作用，可能混淆实验结果的解释，从而阻碍标准化和规模化。

为了克服这些局限性，Langenau小组建立了一个成年斑马鱼异种移植模型，该模型允许，通过将prkdc（编码DNA活化蛋白激酶催化亚单位）和il2rga（编码白细胞介素2受体-γa）的纯合失活突变导入透明casper斑马鱼体内，实现人和小鼠细胞的长期植入和增殖。这些有免疫缺陷的斑马鱼是透明的，缺乏T细胞、B细胞和自然杀伤细胞，并能在37°C存活。值得注意的是，在37℃饲养斑马鱼没有发现任何缺陷，除了增加了饲养的工作量。生存能力高，斑马鱼对这种温度的适应时间很长。

此外，经过驯化的斑马鱼在超过28天的时间内成功地移植了大量的人类癌细胞系和PDX。与幼鱼移植试验相比，成鱼移植试验的另一个主要优点是，每只成年斑马鱼可使用的移植细胞数量显著增加（每只斑马鱼可使用200万个细胞），此外，还有实验窗口较长和人体生理温度的优点。生长动力学、细胞增殖和凋亡率与NSG小鼠体内相同肿瘤的生长动力学、细胞增殖和凋亡率相同。基于在小鼠模型中的经验，我们期望prkdc-/- il2rga-/-品系的进一步工程可以克服当前的限制，例如，由于鱼类和人类细胞因子之间的有限保守性，或残余适应性免疫，并进一步提高稳定性和增加人类肿瘤的范围移植。

 （3）斑马鱼的药物测试：

用大量的斑马鱼移植患者的肿瘤或转基因模型可以测试大量的临床可用药物，由于斑马鱼化身与临床决策的配对反应可以帮助对患者进行分层，以获得适合其肿瘤的治疗(图3)。斑马鱼虚拟化身的逻辑优势与其他体内特定患者虚拟化身相比，显著增加了药物试验的可能规模(表1)。

表一如下：

（4）斑马鱼的用药途径：

治疗斑马鱼的方法是将药物直接加入水中，并将幼鱼和成鱼浸入水中。此外，成人可以通过腹腔注射给药或口喂法（图3）。通过浸没疗法将药物输送到幼鱼体内，使得无法准确评估药物剂量、药代动力学和药效学（图3）。

图3如下：

相比之下，通过口服管饲或腹腔注射给药的临床相关药物给药可以更严格地控制给药，也可以使用混合血浆样品通过质谱法评估药代动力学。此外，与浸没不同的是，灌胃和腹腔注射可以有效输送水溶性较低的小分子和抗体。人类、小鼠和斑马鱼之间的药代动力学差异是该领域一直面临的一个重要问题，但实证测试已被有效地用于确定口服灌胃和药浴治疗的剂量转换因子。

此外，口服化疗药物(替莫唑胺)和靶向治疗(奥拉帕尼)对成年斑马鱼PDXs (zPDXs)产生的血液药代动力学特征与人类和小鼠非常相似。因此，虽然在每个病例的基础上优化药物剂量是必要的，但有可靠的证据表明，药物动力学本身并不是斑马鱼化身的跨物种障碍。

（5）临床反应测定：

患者对癌症治疗的临床反应是通过测量磁共振成像或计算机断层扫描的成像数据的大肿瘤直径变化来确定的。根据大小变化，根据reCisT标准对患者的反应进行分类。在小鼠异种移植肿瘤中，卡尺，计算机断层扫描或正电子发射断层扫描，或荧光素酶生物发光通常用于肿瘤反应测量。

在斑马鱼中，药物反应通过几种方式进行测量：（1）在未标记肿瘤细胞的透明受体中直接成像（特别是对于作为黑色素瘤的天然猪肿瘤），（2）肿瘤大小的荧光成像（通过用荧光蛋白病毒载体转导患者来源的细胞（例如，增强GFP），或用FUCCI4显示细胞周期相，（3）通过将癌细胞暴露于活性荧光染料，或（4）非侵入性地使用超声波。细胞数（幼鱼zPDX）和肿瘤表面积（幼鱼和成鱼zPDX）已被用作使用RECIST标准的肿瘤反应测量。这些方法与斑马鱼平台提供的高通量体内筛选相结合，提供了更快的成像终点，利用实时评估药物效应的能力降低到单细胞分辨率。

 （6）可以测试的药剂类型：

早期强调的化身模型和不同生物中的目标保护之间的生物学差异，直接影响了哪种治疗药物可以被有效评估(如文中表1)。

许多抗癌药物已成功应用于斑马鱼，包括各种类型的化疗，小分子抑制剂如达沙替尼和抗体疗法如贝伐珠单抗和西妥昔单抗。例如，成人zPDX模型被用于鉴定多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂olap- arib和化疗药物替莫唑胺联合治疗横纹肌肉瘤的有效性。联合治疗的疗效在小鼠异种移植模型中得到了再现，进一步证明了两种受体生物模型在药物测试中的等效性。

该药物组合目前正进入儿科横纹肌肉瘤的临床试验，并代表了从使用斑马鱼的异种移植临床前研究开始的联合治疗的头一个临床试验。化疗对斑马鱼和人类的靶点具有高度的保守性，而使用小分子或抗体的靶向治疗则高度依赖靶点的结构保守性来发挥作用。因此，通常只有在异种移植细胞移植模型中才能有效地评估癌细胞的内在靶点。

另一方面，针对肿瘤微环境（TME）的靶向治疗将根据确切的靶点保守性表现出更大程度的可行性。类似的考虑也适用于转基因模型，在转基因模型中，我们通常引入人类版本的驱动癌基因，但针对其他基因或合成致死方法的治疗是否成功取决于靶点的保护。与使用NSG小鼠的移植研究一样，zPDX模型中缺乏患者特异性免疫肿瘤微环境和/或协同进化，以及缺乏跨物种靶点保护（例如，PD1等免疫检查点的有限序列保护，PDL1和CTLA4）对在斑马鱼化身中提供一个有效的代理进行评估提出了挑战患者对针对免疫TME的药物的反应。

另一个混杂因素，特别是在幼鱼是潜在的毒性作用，许多抗癌药物对斑马鱼受体幼鱼本身，因为它经历了一个快速发展阶段。事实上，观察到的肿瘤缩小也可能是毒性对受体本身的间接影响的结果，这将损害其支持癌细胞生长的能力。

（7）预测反应和抵抗：

斑马鱼化身对精确癌症治疗的价值归结为：（1）预测能力，（2）实验规模和（3）为临床决策提供信息的分析持续时间。

因此，值得考虑斑马鱼化身在预测药物敏感性和耐药性方面的益处和局限性。耐药性通常分为原发性或固有性耐药性（当患者对药物无反应时）和继发性或获得性耐药性（当患者初对药物敏感时产生耐药性）。前者通常由肿瘤显性克隆或TME的遗传组成决定，而后者则被认为是通过达尔文选择较小的遗传抗性的预先存在的克隆或转录拉马克适应，然后对一个性状进行遗传固定而获得的。

以斑马鱼实验为例，在BRAF或KIT驱动的黑色素瘤背景下，通过spred1失活的快速组合转基因模型，探讨了斑马鱼的原代遗传抗性。用靶向疗法对成年转基因斑马鱼进行浸没治疗，以治疗粘膜黑色素瘤患者，结果显示这种普遍的功能丧失遗传事件导致对抑制KIT酪氨酸激酶活性的药物产生耐药性（如文中图3）。

机制研究进一步表明，MEK和KIT抑制剂联合应用的潜在疗效。由于药物暴露时间短确定主要抗性，幼鱼和成虫ZPDX都是很适合解决这个问题的模型。从肿瘤活检标本中提取的幼鱼zPDXs与肿瘤类器官非常相似，在手术前的新辅助治疗中可能特别有用，有助于快速选择有效的化疗方案。

另一方面，这样一个短期的幼鱼移植试验，每个受体的细胞数量有限，不太可能是一个很好的预测继发性耐药性。这在Fior等人的工作中很明显。模拟多克隆肿瘤，移植前将两个等基因细胞系（含突变KRAS的HCT116细胞和含野生型KRAS的Hke3细胞）按1:1混合，每个细胞用不同的荧光颜色标记。虽然多克隆肿瘤暴露于叶酸-5-氟尿嘧啶-奥沙利铂（FOLFOX）化疗方案导致肿瘤整体缩小，但Hke3耐药克隆的大小没有改变。

因此，如果没有不同的颜色标记，即使一个非常大的亚克隆没有反应，一个实际的肿瘤也会被认为是敏感的。我们有理由推测，较长的时间窗口和较大数量的成体zPDXs细胞将更好地定位这些模型，以预测基于较小的遗传抗性克隆的扩增的二级抗性机制，或允许转录适应所需的时间。

总的来说，这些化身准确建模和预测抵抗力的能力对于他们的临床应用至关重要。

参考资料：

[1] Morrison, C. Fresh from the biotech pipeline — 2018. Nat. Biotechnol. 37, 118–123 (2019).

[2] Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E. & Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nat. Rev. Cancer 15, 747–756 (2015).

[3] Hyman, D. M., Taylor, B. S. & Baselga, J. Implementing genome-driven oncology. Cell 168, 584–599 (2017).