环特斑马鱼研究_健脾益气摄血颗粒对斑马鱼肠道出血模型的止血作用评价

核心摘要

目的：建立斑马鱼血小板计数减少并发肠道出血模型，观察健脾益气摄血颗粒对斑马鱼肠道出血的止血效果，为临床推广应用提供依据。

方法：在检测致死药物浓度后，用辛伐他汀诱导斑马鱼肠道出血模型，并以确定的健脾益气摄血颗粒56、167 和500μg /ml 3 个不同剂量为干预药物，以斑马鱼肠道出血发生率、肠道出血减少率以及止血率为评定指标，观察健脾益气摄血颗粒对斑马鱼肠道出血的止血效果。

结果：模型对照组斑马鱼肠道出血发生率为70%，经健脾益气摄血颗粒56、167 和500μg /ml 浓度干预后，斑马鱼肠道出血发生率分别为37%、40%和80%。其中，健脾益气摄血颗粒56μg /ml、167μg /ml 两个剂量组与模型对照组比较，差异有统计学意义( P ＜ 0.05) ，表明健脾益气摄血颗粒中小剂量在浓度可明显减少斑马鱼肠道出血的发生率。模型对照组斑马鱼肠道内血小板计数为16.60 个，经健脾益气摄血颗粒56、167 和500μg /ml 浓度干预后，斑马鱼肠道内血小板计数分别为7.60、8.00 和15.50 个，与模型对照组比较，差异有统计学意义( P 分别为＜ 0.01、0.01、0.05) 。肠道止血作用分别为54%、52%和7%。表明健脾益气摄血颗粒中小剂量对斑马鱼肠道出血具有明显的止血效果。

结论：健脾益气摄血颗粒小剂量( 56μg /ml) 与中剂量( 167μg /ml) 不但能够明显减少斑马鱼肠道出血率，也有良好止血疗效。

文丨王珺、王博、张蕴、周郁鸿、徐懿乔、张勇、陈信义

发表于《医学研究杂志》2020年9月第49卷第9期（本文做了部分节选）

一、综述

ITP （特发性血小板减少性紫癜）是临床常见的出血性疾病，多数病例可见多部位出血，如皮肤瘀斑、瘀点或黏膜出血，严重者可见内脏出血，如尿血、便血等。

基于审证求因与辨证施治理论，急性ITP 多见热邪导致的“热迫血行”证候，宜“清热解毒凉血止血”治疗; 慢性ITP多由脾气虚弱导致“气不摄血”证候，宜“健脾益气摄血”治疗。

课题组在前期临床研究中发现，具有“健脾益气摄血”功效的健脾益气摄血颗粒能够明显改善ITP 患者临床症状，提升外周血小板计数，并有较好的止血效果。基础研究也证实，健脾益气摄血颗粒可以明显降低出血模型斑马鱼脑、肝脏、心脏出血发生率。

本研究采用辛伐他汀诱导斑马鱼肠道出血模型，并对健脾益气摄血颗粒止血效果进行了评价。

二、实验结果

1、药物非致死浓度测定:

参照既往实验结果的药物致死浓度，并经过反复实验探索，确定健脾益气摄血颗粒实验浓度设为125、250、500、1000 和2000μg /ml，在实验过程中观察斑马鱼死亡尾数，根据死亡尾数确定药物非致死浓度，详见表1。

健脾益气摄血颗粒2000μg /ml 和1000μg /ml 两个浓度组均导致30 /30 尾斑马鱼死亡，死亡率为100%。其余各组和正常饲养对照组比较，无明显毒性表型。因此，确定健脾益气摄血颗粒对斑马鱼的MNLC 为500μg /ml。在随后的实验中按照非致死药物浓度作为递减实验剂量，即56、167 和500μg /ml。

表1 健脾益气摄血颗粒不同浓度下斑马鱼死亡数量

2、斑马鱼出血模型探索:

随机选取4dpf 野生型AB 品系斑马鱼180 尾置于6 孔板中，分别给予辛伐他汀1、2、4、6 和8μmol /L 浓度的水溶液。同时，设置正常饲养对照组，每孔斑马鱼尾数为30 尾，每孔容量为3ml，给药24h 后，用邻联茴香胺染色后，在解剖显微镜下观察和记录每个实验组肠道出血的斑马鱼数量( n) ，并依据公式计算出血发生率，评价建模是否成功，详见表2、图1。

表2 不同浓度辛伐他汀处理24h 后斑马鱼肠道出血发生率

与正常饲养对照组比较，* P = 0.000; 每组斑马鱼为30 尾，因在实验中有观察到斑马鱼未出血的死亡尾数，故表中24 与29 均为去除死亡的斑马鱼数。

图1 辛伐他汀不同浓度斑马鱼出血表型图

根据造模结果，以出血量辛伐他汀诱导斑马鱼出血剂量，取中间数值，确定辛伐他汀6μmol /L 浓度为造模剂量浓度。

3、肠道出血减少率统计:

随机选取4dpf 野生型AB 品系斑马鱼150 尾于6 孔板中，分别给予健脾益气摄血颗粒56、167 和500μg /ml 浓度。同时，设置正常饲养对照组和模型对照组。

每孔斑马鱼尾数为30尾，每孔容量为3ml，辛伐他汀浓度为6μmol /L，给药24h 后，在解剖显微镜下观察和记录每个实验组肠道出血的斑马鱼数量( n) ，以出血发生率评价健脾益气摄血颗粒减少出血发生效果，详见表3、图2。

模型对照组斑马鱼肠道出血发生率为70%，表明模型建立成功。经健脾益气摄血颗粒56、167 和500μg /ml 浓度干预后，斑马鱼肠道出血发生率分别为37%、40%和80%。其中，健脾益气摄血颗粒56、167μg /ml 两个剂量组与模型对照组比较，差异有统计学意义( P ＜ 0.05) 。

表3 健脾益气摄血颗粒处理后斑马鱼肠道出血发生率

与模型对照组比较，* P ＜ 0.05

图2 健脾益气摄血颗粒处理后斑马鱼肠道出血表型图

绿色虚线区域为斑马鱼肠道; 绿色箭头指向肠道出血部位

4、健脾益气摄血颗粒止血疗效统计:

随机选取4dpf 血小板荧光斑马鱼150 尾于6 孔板中，分别给予健脾益气摄血颗粒56、167 和500μg /ml 剂量浓度水溶液。

同时，设置正常饲养对照组和模型对照组，每孔斑马鱼尾数为30 尾，每孔容量为3ml，给药24h后，实验各组随机选择10 尾斑马鱼在荧光显微镜下，观察肠道内血小板聚集情况、拍照并保存图片; 利用尼康NIS － Elements D 3.10 高级图像处理软件进行图像分析，对每尾斑马鱼逐一计数肠道内血小板计数( n) ，以肠道内血小板计数的统计结果，评价健脾益气摄血颗粒的肠道止血效果，详见表4、图3。

各实验组斑马鱼均未出现死亡。模型对照组斑马鱼肠道内血小板计数为16.60 个，与正常饲养对照组( 2.20个) 比较，差异有统计学意义( P = 0.000) 。模型建立成功。以健脾益气摄血颗粒56、167 和500μg /ml 浓度干预后，斑马鱼肠道内血小板计数与模型对照组比较，差异有统计学意义( P 分别为＜ 0. 01、0.01、0. 05) 。肠道止血率分别为54%、52%和7%( 表4) 。

表4 健脾益气摄血颗粒处理后斑马鱼肠道止血作用

与模型对照组比较，* P ＜ 0.01

图3 健脾益气摄血颗粒处理后肠道血小板聚集表型图

黄色虚线区域为定量分析部位

三、讨论

中医认为脾具有“统血”功能，且有“脾为后天之本，气血生化之源”之称。通过临床观察与文献分析，免疫性血小板减少症，尤其是慢性患者“脾不统血证”是临床常见的证候类型，而“健脾益气摄血法”能够针对慢性免疫性血小板减少症病机与证候治疗。

免疫性血小板减少症主要临床表现除外周血血小板计数减少外，多部位不同程度出血是临床常见症状。前期基础研究证实，“健脾益气摄血颗粒”对不同浓度的辛伐他汀在不同时间诱导的斑马鱼脑、肝脏、心脏出血具有良好的止血效果。

基于这些研究结果，笔者试图探索辛伐他汀诱导斑马鱼肠道出血模型，并以健脾益气摄血颗粒为干预药物，观察其对斑马鱼肠道出血的止血疗效。

研究结果表明，模型对照组斑马鱼肠道出血发生率为70%，经健脾益气摄血颗粒56、167 和500μg /ml 浓度干预后，斑马鱼肠道出血发生率分别为37%、40%和80%。

其中，健脾益气摄血颗粒56、167μg /ml 两个剂量组与模型对照组比较，差异有统计学意义( P ＜ 0.05) ，表明健脾益气摄血颗粒在中小剂量浓度可明显减少斑马鱼肠道出血的发生率。

模型对照组斑马鱼肠道内血小板计数为16.60 个，经健脾益气摄血颗粒56、167 和500μg /ml浓度干预后，斑马鱼肠道内血小板计数分别为7.60、8.00 和15.50 个，与模型对照组比较，差异有统计学意义( P 分别为＜ 0.01、0.01、0.05) 。肠道止血作用分别为54%、52%和7%，表明健脾益气摄血颗粒中小剂量对斑马鱼肠道出血具有明显的止血效果。

对于上述研究结果，有两个问题需要解释：

首先，由于观察辛伐他汀诱导斑马鱼肠道出血情况较为困难。邻联茴香胺主要对血红蛋白进行着色，是反映红细胞分布的指标，因此，选择邻联茴香胺来观察肠道出血情况。笔者基于血小板止血的生理特点，选用转基因血小板荧光斑马鱼Tg(-6.0itga2b: EGFP)为模式动物，以肠道出血部位血小板聚集现象判断止血效果( 血小板在出血部位聚集，有利于出血部位止血) 。这一方法在国内尚属首次，可能存在着一定的局限性，有待于进一步探究。

其次，在模型对照组和药物组中观察到斑马鱼肝脏也有明显的出血，而且肝脏中有大量的血小板聚集。这一现象表明健脾益气摄血颗粒并未引起血小板生成减少，而是对肠道出血有止血疗效。

健脾益气摄血颗粒小剂量( 56μg /ml)与中剂量( 167μg /ml) 不但能够明显减少斑马鱼肠道出血率，也有良好的止血疗效。但大剂量( 500μg /ml) 没有明显的止血效果，其可能的解释是适当剂量( 中小剂量) 的健脾益气摄血颗粒具有止血效果，而大剂量可能是由于中药多成分、多靶点而出现的脱靶效应，但这一解释并没有得到临床研究数据的证实，需要进行不同剂量的临床疗效探索性研究，进而为临床合理用药提供依据。

参考资料：

[1] 黄炜祺，周咏明． 原发免疫性血小板减少症的免疫机制研究进展［J］． 中国实验血液学杂志，2019，27( 4) : 1321 － 1324

[2] 于斌． 升血小板胶囊联合醋酸泼尼松治疗原发性免疫性血小板减少症临床疗效观察［J］． 中国药物与临床，2019，19 ( 8 ) :1319 － 1320

[3] 谢英丽，王小路，葛仁英． 健脾益气摄血方联合重组人血小板生成素治疗脾气虚型免疫性血小板减少症疗效及对患者疲劳状况的影响［J］． 现代中西医结合杂志，2018，27 ( 33) : 3696 －3699