Cell Stem Cell：基于人类胎儿肺泡类器官模型揭示肺泡发育及相关呼吸系统疾病机制

编者按

肺泡发育的变异与疾病易感性密切相关。研究表明，人类气道在受孕5-16周时形成分支，到26周左右进一步分化为肺泡上皮[1-2]。由于缺乏合适的模型，肺泡发育的相关分子机制很大程度仍然未知。

在本研究中，研究人员利用人胎儿肺组织发现决定肺泡命运的上皮祖细胞，并通过体外培养成的类器官模型挖掘肺部细胞发育的关键进程。利用该模型，研究人员从功能上验证了人类肺泡发育过程中细胞间的相互作用，确定肌成纤维细胞在发育肺泡中的空间模式。同时，该研究还发现了可调控肺泡成熟的重要转录因子NKX2.1，为疾病建模提供了可基因编辑的人源AT2细胞。

一、 研究成果

1. 对不同周期的人胎肺尖端区域组织进行单细胞测序，鉴定出包括气道祖细胞、AT1、AT2等在内的11个上皮细胞簇。聚类结果显示这些细胞主要分布于两个阶段，即受孕后5-11周（早中期）和受孕后15-22周（晚期）。其中，晚期尖端细胞与气道祖细胞、AT2和AT1细胞密切相关，表明晚期时尖端细胞获得了肺泡分化能力。

对差异基因进行分析，结果显示CD44和CD36的双重表达标志受孕15-21周的肺尖端上皮群体，该群体共同表达尖端祖细胞和肺泡标志物。而在肺泡形态分化之前，CD36在受孕13-15周时已得到稳定的表达。此时，SFTPC转录增加，SOX9转录逐渐减少，表明AT2谱系特征的获得在肺泡分化之前已逐渐发生在尖端。

2. 为了确认受孕17-21周肺部远端尖端细胞的命运潜能，研究人员对表达

CD44+ CD36+细胞进行体外培养，得到囊状和折叠状两种形态的类器官。

前者表达尖端祖细胞特异性基因，无AT2相关表达，接近气道分支阶段的尖端标记，被认定为LinNEG谱系；而折叠状类器官同时表达祖细胞及AT2细胞标记物，被命名为LinPOS谱系。转录组分析结果显示呼吸道气体交换、肺泡发育及典型的Wnt通路信号在LinPOS类器官中有显著富集，其富含AT2标记物、Wnt信号相关基因及低水平气道基因。

这些数据表明传代的LinPOS类器官可概括肺泡及晚期肺尖祖细胞的关键分子特征。其中，只有CD44+ CD36+细胞衍生形成的LinPOS类器官能够在多次传代中维持自我更新能力。

3. 为了测试LinPOS类器官是否具有AT2的分化潜力，研究人员向培养体系中加入DAPT、DCI、CHIR 和SB431542，单细胞测序结果表明在条件培养基体系下LinPOS类器官很容易分化为成熟的AT2细胞。

同时，研究人员发现晚期尖端上皮细胞具有高度可塑性，可以在肺泡和气道分化之间轻松切换，而这一过程受到Wnt和FGF信号通路的协调控制。

4. 为了验证Wnt和FGF信号对体内远端尖端上皮细胞的谱系决定作用，研究人员对受孕后17-21周的组织进行单细胞测序分析，结果显示WNT2与FGFR4在这些阶段的肺泡成纤维细胞中共同表达。

通过将LinPOS类器官与成纤维细胞共培养，并使用Wnt信号通路抑制剂及激动剂进行处理，结果表明分化的成纤维细胞发出的Wnt信号可促进AT2细胞的识别，而肌成纤维细胞可分泌Wnt抑制剂NOTUM，提供空间模式，支持了分化的肺泡上皮由肌成纤维细胞塑造的概念。

5. 为了探究影响细胞分化的关键转录因子，研究人员利用LinPOS类器官进行了染色质可及性和测序分析，发现NKX2.1和TFAP2C等转录因子基序可及性很高，且这些转录因子均被高度转录。

通过对7-9 pcw类器官过表达NKX2.1 和TFAP2C，前者可导致AT2标记物的上调以及尖端祖细胞标记物的下调；而后者可显著增加基底细胞标志物的表达，故而这两者被认为分别是AT2和基底细胞系分化的关键调控因子。

在LinPOS类器官中NKX2.1和TFAP2C的敲低实验进一步支持了NKX2.1在促进肺泡和抑制气道分化中的重要性。NKX2.1表达的小幅下降足以降低AT2特异性基因的表达，增加TP63，而TFAP2C 的敲除不影响AT2基因的转录。

6. 此外，通过对缺乏同源结构域的NKX2.1过表达，研究人员发现DNA结合是NKX2.1促进AT2分化所必需的。已知NKX2.1变异被报道与多种呼吸道疾病相关[3-5]，基于此可通过基因编辑进行不同部位的突变，从而预测人类变异体对肺泡分化的不同影响。

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