斑马鱼研究丨通过L929细胞与斑马鱼模型评价马尾藻对紫外线B诱导光损伤的保护作用

近期，福建省水产研究所陈贝博士研究团队与厦门大学生命科学学院的研究团队共同在《BMC complementary and alternative medicine》上发表了题为“Photoprotective effects of Sargassum thunbergii on ultraviolet B-induced mouse L929 fibroblasts and zebrafish”的研究论文。

本项目研究由环特生物提供斑马鱼实验支持，该研究通过L929细胞与斑马鱼模型评价马尾藻对紫外线B诱导光损伤的保护作用，旨在探讨马尾藻乙醇提取物的光保护效应。

当前，随着人们生活水平的逐步提升,人们对延缓皮肤衰老的需求愈加强烈,保护皮肤的意识也逐渐提高。皮肤是人体与外界环境隔离的第一道屏障。持续暴露于紫外线B（UVB），可通过改变与炎症、氧化应激和DNA损伤相关的信号通路，引发急性或慢性的皮肤失调、损伤、皮肤癌和皮肤老化等皮肤病变。如何预防皮肤暴露UV或缓解皮肤UV损伤,从而延缓皮肤光老化日益受到人们的关注。

海藻具有丰富的生物活性化合物，具有抗氧化和抗感染的特性。通过制备马尾藻富含酚提取物（STPE），用L929成纤维细胞和斑马鱼评价其抗UVB损伤的活性。用40%乙醇和大孔树脂XDA-7提取并纯化STPE。分析活性氧（ROS）和抗氧化标志物，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。通过炎症细胞因子基因和蛋白表达确定STPE对UVB诱导炎症的影响；通过蛋白印迹法测定核因子-κB（NF-κB）通路中信号分子的表达；通过Hoechst 33342染色法分析并观察DNA凝聚情况；通过斑马鱼模型尾鳍面积和 ROS测量进行体内评价。

结果：STPE的总多酚含量为72%，STPE降低了L929细胞中的ROS含量，提高了SOD和CAT活性，显著降低了MDA含量，从而有效缓解了UVB辐射诱导的氧化损伤。STPE抑制TNF-α、IL-6和IL-1α的mRNA和蛋白表达。与UVB对照相比，STPE在浓度为20和40μg/mL时逆转了DNA凝聚。此外，STPE抑制UVB照射后L929细胞中的NF-κB信号通路的激活，减轻DNA凝聚。1.67μg/mL STPE显著增加了斑马鱼尾部fn面积，0.8-1.6μg/mLSTPE显著消除了UVB辐射后过量的ROS。

结论：STPE通过下调NF-κB信号通路，抑制UVB诱导的氧化应激、炎性细胞因子表达和DNA凝聚，表明它可以防止UVB诱导的光损伤，并具有用于皮肤病治疗的临床开发潜力。

● 综述

在不被臭氧层吸收的紫外线 (UV) 类型中，紫外线 B (UVB)（波长 280-315 nm）是皮肤损伤发病机制的主要环境风险因素。

UVB的波长较短,比UVA (320–400 nm) 的能量强30-40倍。许多皮肤病，如癌症、光老化、晒伤和色素沉着，都与 UVB 暴露密切相关。由于其波长较短，UVB主要被表皮吸收；然而，它也可以穿透该皮肤层到达真皮并影响成纤维细胞的生理功能。对紫外线照射皮肤或真皮成纤维细胞的研究主要集中于DNA突变、炎症和光老化。

海洋生物可通过物理或化学的阻隔作用、抗氧化、色素的抑制作用以及核酸和蛋白的修复功能等多种生理和生化防御机制，减少UV辐射对自身造成的损害。最近，由于皮肤健康行业对抗衰老、抗过敏和美白天然产品的需求不断增长，海洋生物活性物质逐渐被应用于抗光老化化妆品的开发中,例如海洋多酚、海洋多肽、海洋多糖、海洋类胡箩ト素、海洋萜类化合物等，这些生物活性物质通常可通过多种光保护机制共同作用，缓解UV辐射对皮肤的伤害。

从腔昆布(E.cava)中提取的褐藻多酚间苯三酚、鹅掌菜酚和二鹅掌菜酚均可降低UVB辐射后细胞内ROS含量，孵育褐藻多酚后细胞活力呈剂量依赖性增加,DNA损伤也显著减少；从铁钉菜（Ishige okamurae）中提取的褐藻多酚DPHC通过降低细胞内 ROS 水平、减少受损的DNA尾部长度，引起成纤维细胞形态变化，对UVB辐射具有强大的保护特性。

在过去的几十年中，海藻一直是天然产品的重要来源，可用于寻找具有药理和营养特性的新化合物。黑藻是一种重要的经济褐藻，分布于中国和日本海域，含有许多生物活性化合物，如吲哚衍生物、吲哚酮哌嗪生物碱、醌衍生物、多酚和多糖。S. thunbergii生活在潮间带，由于潮汐变化而发生多种变化，包括高太阳辐照度、干燥、盐度和温度的变化。因此，我们推测，黑曲霉中的酚类化合物可能具有紫外线防护活性。然而，据我们所知，桑伯格链球菌的光保护活性以前从未报道过。

据报道，小鼠 L929 成纤维细胞系是一种用于药物/化学品光毒性评估的、有效的体外筛选测试系统。斑马鱼（Danio rerio），被越来越多地视为评价UVB保护化合物对鳍损伤和ROS生成的一种不错的功效评价模型。本研究中，我们建立了一个暴露于UVB 的L929细胞和斑马鱼光损伤模型，以研究S. thunbergii富含酚类提取物 (STPE) 的 UVB 光保护活性。

● 实验部分

1.1 STPE对斑马鱼生长的影响

收集受精后 2 天 (dpf) 发育的 AB 野生型斑马鱼胚胎，每个实验组随机分为 30 个胚胎。胚胎用浓度为 5、10、25、100、250、500、1000 和 2000 μg/mL 的 STPE 处理 24 小时，并暴露于紫外线治疗仪。UVB 暴露后，所有胚胎以 5 dpf 计数存活率。

1.2 STPE对UVB照射斑马鱼尾鳍损伤的修复作用

收集在 2 dpf 发育的胚胎，用不同浓度的 STPE（0.56、1.67 和 5 μg/mL）处理胚胎 24 小时。从每组中随机选择10条斑马鱼在解剖显微镜下观察它们的尾鳍，分析图像以计算其尾鳍面积。尾鳍区域用于评估 STPE 对斑马鱼紫外线照射引起的皮肤损伤修复的影响。

1.3 STPE 对 UVB 照射斑马鱼 ROS 清除的影响

收集在 2 dpf 发育的胚胎，用不同浓度的 STPE（0.8、1.2 和 1.6 μg/mL）或 EGCG（30 μg/mL）处理胚胎 24 小时。测量胚胎 (FI) 的荧光强度，STPE对斑马鱼氧自由基清除的影响计算如下：

● 实验结果

1. STPE 逆转 UVB 诱导的细胞活力下降

用 40% 无水乙醇在 70°C 下提取S. thunbergii两次，用大孔吸附树脂 XDA-7 纯化得到 STPE。使用比色法 Folin-Ciocalteu 方法测定 STPE 的总多酚含量为 72%。

为了确定 STPE 细胞毒性，L929 细胞用不同浓度的 STPE（0-320 μg/mL）处理 24 小时。与未处理组相比，浓度为 10-40 μg/mL 的 STPE 对细胞活力没有影响（p  > 0.05；图 1a），尽管在 80 μg/mL 时观察到细胞毒性（p  < 0.05）。基于此，10–40 μg/mL STPE 用于后续测定。

用不同剂量的 UVB (0-320 mJ/cm 2 ) 处理细胞并培养 24 小时以确定诱导光损伤的适当辐照剂量。UVB 以浓度依赖性方式降低细胞活力（图1b）；20 兆焦耳/厘米2UVB 使细胞活力降低了大约 50%，并在随后的实验中被选为 UVB 剂量。与实验对照相比，单独暴露于 UVB 后，细胞活力降低至 60%（图1c）。然而，用 STPE (10–40 μg/mL) 预处理细胞以浓度依赖性方式逆转了这种效应，并且在 40 μg/mL 时与 UVB 模型组显著不同。

图1：STPE 可逆转 UVB 引起的细胞活力下降。( a ) STPE和( b ) UVB在不同浓度或剂量下对L929细胞活力的影响，以及( c ) STPE对UVB (20 mJ/cm 2 )对L929细胞损伤的保护作用。带有“*”的均值差异显著（p  < 0.05）

2. STPE 抑制氧化应激和脂质过氧化

评估由UVB诱导的STPE对细胞内ROS的清除作用，测量STPE对UVB暴露产生的细胞内ROS的清除作用（图2a）。与对照细胞相比，暴露于UVB的细胞中的ROS 水平增加了2.35倍。然而，用浓度增加的STPE对细胞进行24小时预处理，会导致细胞内ROS浓度依赖性降低。

图2：STPE抑制UVB诱导的氧化应激和脂质过氧化。STPE对L929细胞( a ) ROS和 ( b )MDA含量以及 ( c ) SOD和 ( d ) CAT活性的影响。带有“*”的均值差异显著（p  < 0.05）

SOD和CAT是重要的抗氧化酶，可保护组织免受氧化损伤。MDA产生用于评估由于氧化应激引起的细胞内脂质过氧化。通过测量SOD、CAT 和 MDA的水平来评估STPE的保护机制。与对照组相比，UVB暴露后SOD水平降低；然而，这被20和40μg/mL的STPE预处理所消除（图2c）。在40μg/mL的STPE处理后，CAT活性升高（图2d）。UVB ( p < 0.05 ) 诱导的MDA含量增加（图2 b）被 40μg/mLSTPE预处理逆转（p  < 0.05）。

3 STPE对UVB照射斑马鱼尾鳍损伤的修复作用

近年来，斑马鱼已被广泛用作体内氧化应激模型，来研究紫外线辐射的保护作用。实验方案的示意图如图3a所示 。本研究首先探讨了 STPE 对野生型 AB 株斑马鱼生长的影响，从而为后续实验提供有关最大安全 STPE 浓度的数据。在紫外线照射后，STPE在浓度为10μg/mL及以上时会导致高死亡率。5μg/mL STPE未观察到明显异常；因此，这是斑马鱼紫外线损伤模型中使用的最大实验浓度。

图3：评价STPE对UVB照射斑马鱼的光保护作用。使用受精后2天 (dpf) 的斑马鱼胚胎。a为本研究中进行的实验方案的示意图。b、c为UVB诱导的畸形鳍表型可以通过 STPE 减弱。d为STPE 对斑马鱼UVB诱导的 ROS产生的抑制作用。p值小于0.05的差异被认为具有统计学意义并用“*”表示。

STPE修复暴露于UVB辐射的斑马鱼皮肤损伤的潜力，如图3b和c所示，斑马鱼的尾鳍暴露于紫外线辐射后表现出粗糙和起皱的表型。茶多酚对斑马鱼皮肤损伤的修复效果为29%，说明阳性对照处理显著修复了斑马鱼皮肤损伤。用0.56、1.67和5μg/mL 的STPE处理斑马鱼导致尾鳍面积，分别与对照模型相比，对皮肤损伤修复的影响分别为3%、24% 和 6%。总的来说，STPE 对斑马鱼皮肤损伤有显著的恢复作用。

4 STPE对UVB辐射斑马鱼的ROS清除作用

STPE对斑马鱼中UVB介导的ROS诱导的影响如图3d所示。UVB组荧光值为6271±264（p  <0.001），高于正常对照组（1169±124），表明模型建立成功。 与UVB组相比，30 μg/mL EGCG阳性对照组（1122±39）的荧光值降低了82%（p <0.001）。STPE组在0.8、1.2 和 1.6μg/mL 浓度下的荧光值分别为 1818 ± 78、1834 ± 116 和 950 ± 30，此时与UVB组相比，细胞内ROS积累减少了 71、71 和 85%（p < 0.001)。这些发现表明，STPE 对斑马鱼模型中的 ROS 具有显著的清除作用。

● 讨论

本研究中，我们从S. thunbergii中分离出富含酚类的提取物，并在体外使用L929细胞、在体内使用斑马鱼模型评估其对UVB诱导的光损伤的保护作用。实验数据表明，对 UVB的保护作用是通过 STPE 的抗氧化、抗炎和抗凋亡能力来调节NF-κB信号通路介导的（如下图 ）。这项研究有助于对STPE皮肤保护作用的理解。我们将继续努力获得一种高度纯化和稳定的STPE分子，以进一步用作潜在的保护剂，以减少因UVB引起的皮肤损伤。