斑马鱼研究丨斑马鱼肿瘤异种移植模型在抗癌药敏感性评价中的应用

目的：应用人类肺癌、胃癌和肝癌细胞斑马鱼异种移植模型，分别评价５种临床常用抗癌药的体内敏感性。方法 ：分别建立斑马鱼肺癌 Ａ549、胃癌SGC-7901和肝癌ＨepＧ２ 异种移植模型，顺铂、紫杉醇、长春瑞滨、恩度和贝伐单抗设计３个剂量分别处理斑马鱼肺癌Ａ549 移植模型，紫杉醇、伊立替康、羟基脲、顺铂和５⁃氟尿嘧啶（５⁃fluorouracil，５-FU）设计2个浓度或剂量分别处理斑马鱼胃癌SGC-7901移植模型，阿霉素、吉西他滨、羟基脲、顺铂和 ５⁃氟尿嘧啶设计3个浓度或剂量分别处理斑马鱼肝癌ＨepＧ2移植模型。实验结束后，使用荧光显微镜进行体内肿瘤定量图像分析，计算药物对斑马鱼体内肿瘤生长抑制率，通过与模型对照组相比，分析是否具有统计学意义。

结果：受试的抗肿瘤药物在斑马鱼肿瘤异种移植模型中均有效，并且基本都呈剂量依赖性。在抗肺癌 Ａ549药敏试验中，药效从高到低分别为贝伐单抗（65％）＞顺铂（55％）＞长春瑞滨（40％）＞恩度（39％ ）＞紫杉醇（27％）；在抗胃癌SGC-7901药敏试验中，药效从高到底分别为羟基脲（46％ ）＞ ５-FU（31％ ）＝伊立替康（31％ ）＞紫杉醇（26％ ） ＞ 顺铂（24％ ）；在抗肝癌ＨepＧ2药敏试验中，药效从高到底分别为顺铂（64％ ） ＞ 羟基脲（56％ ）＞吉西他滨（46％ ）＞ 阿霉素（４５％ ）＞ ５-FU（38％ ）。结论：斑马鱼肿瘤异种移植模型适合用于抗癌药体内药敏试验。

● 综述

世界上每年都会出现大量新的抗肿瘤候选物，大量的人力物力不断地投入到抗肿瘤药物的开发中，然而，每年都有大量的抗肿瘤药物在前期的开发中给科学家带来希望，但在后期的临床研究中被证明是无效的，由此造成的时间、金钱、精力成本巨大。 因此，寻找一种在药物开发早期便能够迅速、准确、高效评价抗肿瘤候选物药效的方法非常必要。

斑马鱼作为一种重要的模式生物，早期主要应用于发育遗传学研究和有毒物质的检测 。近些年来，斑马鱼在各类药物的药效评价方面也起到了越来越重要的作用 。斑马鱼作为一种整体的活体动物模型，在药物评价方面，具备药物在体内吸收、分布、代谢、排泄的完整过程，并且由于其本身的物理特性，斑马鱼又具有类似体外细胞、分子生物学手段快速、高效、经济的优势，是细胞等体外试验模型过渡到鼠科等哺乳动物模型中的一个优势动物模型，在药物的临床前研究阶段有较高应用价值。

斑马鱼肿瘤异种移植模型是抗肿瘤药物研发中一种新兴的实验技术，广泛应用于抗肿瘤药物的早期筛选实验 ，但并未见关于使用该模型专门评价已上市药物药敏性的报道。 因此，本研究以斑马鱼肿瘤移植为动物模型，验证临床常用的抗肿瘤药物在该模型上的药敏性，旨在探索斑马鱼肿瘤异种移植模型是否能够准确评价抗肿瘤药物的效果，为该模型应用于抗癌药物的研发提供实验依据。

● 实验部分

1.1 斑马鱼肿瘤异种移植模型的建立

将标记好的细胞进行细胞计数，调整浓度为 ３×107个细胞／ｍＬ，使用显微注射仪将细胞注射至2dpf 斑马鱼卵黄囊内，注射体积10ｎL，每尾斑马鱼约注射300个细胞。 注射细胞后的斑马鱼放置35℃恒温生化培养箱培养，24ｈ后在荧光显微镜下筛选荧光量一致的斑马鱼，按实验设计进行分组，每组30尾斑马鱼。

1.2 药物处理

根据临床用药相对应的方式，临床口服药物对应斑马鱼水溶给药，临床静脉注射药物对应斑马鱼静脉注射给药。 通过浓度摸索实验，得到各抗癌药物在斑马鱼上的最大耐受剂量（ ＭＴＤ）或浓度（ＭＴＣ）。 在体内药敏试验中，各药物均选择 ３ 个剂量或浓度进行实验，分别为 ＭＴＤ／４、ＭＴＤ／２和ＭＴＤ，ＭＴＣ／４、ＭＴＣ／２ 和 ＭＴＣ。抗非小细胞肺癌Ａ549细胞药敏试验组别和剂量设置见表 １。抗胃癌 ＳＧＣ⁃７９０１ 细胞药敏试验组别和剂量设置见表 ２。抗肝癌ＨepＧ2细胞药敏试验组别和剂量设置见表 ３。移植肿瘤的斑马鱼，不加任何药物处理的为模型对照组。

1.3 荧光拍照及数据采集

抗癌药物处理至5dpf时，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保 存 图 片。进行图像分析，计算癌细胞相对荧光强度总和（Ｓ） ，定量评价各抗癌药物对斑马鱼体内肿瘤生长的抑制作用。肿瘤抑制作用计算公式如下：

统计学分析采用方差分析，与模型对照组相比较，Ｐ＜0.05为差异有显著性。

● 实验结果

1. 抗非小细胞肺癌A549细胞的药敏

抗非小细胞肺癌Ａ549细胞药敏试验结果如表４ 和图１所示。 其中，抗肺癌Ａ549细胞药敏试验中，贝伐单抗在剂量为每尾斑马鱼100、200和400ng时，肿瘤生长抑制率分别为 ４％ 、57％ 和 65％ ，与模型对照组比较分别为 Ｐ ＞0.5，Ｐ ＜ 0.001和 Ｐ ＜0.001，当贝伐单抗在剂量为每尾斑马鱼200和 400ng时对肺癌Ａ549细胞有显著的抑制作用。 顺铂在剂量为每尾斑马鱼0.5、１ 和 ２ng时，肿瘤生长抑制率分别为34％ 、35％ 和 55％ ，与模型对照组比较，均对肺癌Ａ549细胞有显著的抑制作用。 恩度在剂量为每尾斑马鱼20、40和80ng时，肿瘤生长抑制率分别为11％ 、12％ 和39％ ，与模型对照组比较，当在剂量为每尾斑马鱼80ng时对肺癌Ａ549细胞有显著的抑制作用。 紫杉醇在剂量为每尾斑马鱼0.86、1.71和2.56ng时，肿瘤生长抑制率分别为24％ 、25％ 和27％ ，与模型对照组比较，均对肺癌Ａ549细胞有显著的抑制作用。 长春瑞滨在剂量为每尾斑马鱼0.125、0.25和 0.5ng时，肿瘤生长抑制率分别为 28％ 、40％ 和40％ ，与模型对照组比较，均对肺癌Ａ549细胞有显著的抑制作用。

可见， 抗肺癌Ａ549药效从高到低的药物分别为贝伐单抗（65％ ）＞ 顺铂（55％ ） ＞ 长春瑞滨（40％ ） ＞ 恩度（39％ ） ＞紫杉醇（27％ ）。

2. 抗胃癌SGC-7901细胞的药敏

抗胃癌SGC-7901细胞药敏试验结果如表5和图２所示。 其中，抗胃癌SGC-7901细胞药敏试验中，5-FU在浓度为65、130和260μｇ／ｍＬ时，肿瘤生长抑制率分别为31％ 、29％ 和29％ ，与模型对照组比较，均对胃癌SGC-7901细胞有显著的抑制作用。

羟基脲在浓度为250、500和1000μｇ／ｍＬ时，肿瘤生长抑制率分别为 29％ 、31％ 和46％ ，与模型对照组比较，均对胃癌SGC-7901细胞有显著的抑制作用。顺铂在剂量为每尾斑马鱼0.5、1和2ng时，肿瘤生长抑制率分别为 ５％ 、５％ 和24％ ，与模型对照组比较，当顺铂在剂量为每尾斑马鱼2ng时对胃癌SGC-7901细胞有显著的抑制作用。 伊立替康在剂量为每尾斑马鱼 0.5、１和2ng时，肿瘤生长抑制率分别为4％ 、31％ 和30％ ，与模型对照组比较分别为Ｐ＞0.5，Ｐ ＜0.001和 Ｐ ＜0.001，当伊立替康在剂量为每尾斑马鱼1和2ng时对胃癌SGC-7901细胞有显著的抑制作用。 紫杉醇在剂量为每尾斑马鱼0.86、1.71和2.56ng时，肿瘤生长抑制率分别为３％、25％和26％ ，与模型对照组比较分别为 Ｐ＞0.5，Ｐ＜0.05和 Ｐ＜0.05，当紫杉醇在剂量为每尾斑马鱼1.71和2.56ng时对胃癌SGC-7901细胞有显著的抑制作用。

可见，抗胃癌SGC-7901药效从高到低的药物分别为羟基脲（46％）＞ 5-FU（31％）＝ 伊立替康（31％）＞ 紫杉醇（26％）＞ 顺铂（24％）。

3 抗肝癌HepG2细胞的药敏

抗肝癌HepG2细胞药敏试验结果如表６和图３所示。其中，抗肝癌ＨepＧ2细胞药敏试验中，阿霉素在剂量为每尾斑马鱼0.5、1和2ng时，肿瘤生长抑制率分别为17％、42％和45％ ，与模型对照组比较分别为Ｐ＞0.5，Ｐ＜0.001和Ｐ＜0.001，当阿霉素在剂量为每尾斑马鱼1和2ng时对肝癌HepG2细胞有显著的抑制作用。吉西他滨在剂量为每尾斑马鱼５、10和20ng时，肿瘤生长抑制率分别为46％、45％和46％，与模型对照组比较，均对肝癌HepG2细胞有显著的抑制作用。

羟基脲在浓度为125、250和500μｇ／ｍＬ时，肿瘤生长抑制率分别为33％ 、56％和40％ ，与模型对照组比较，均对肝癌HepG2细胞有显著的抑制作用。顺铂在剂量为每尾斑马鱼0.5、１和２ng时，肿瘤生长抑制率分别为45％、50％和64％，与模型对照组比较，均对肝癌ＨepＧ2细胞有显著的抑制作用。 ５⁃ＦＵ 在浓度为65、130和260μｇ／ｍＬ 时，肿瘤生长抑制率分别为15％ 、33％ 和38％ ，与模型对照组比较分别为Ｐ＞0.5，Ｐ＜0.01和Ｐ＜0.01，当 ５⁃ＦＵ 在浓度为130和260μｇ／ｍＬ时对肝癌HepG2细胞有显著的抑制作用。

可见，抗肝癌HepG2药效从高到低的药物分别为顺铂（64％）＞ 羟 基 脲（56％ ）＞ 吉 西 他 滨（46％ ） ＞ 阿霉素（45％ ）＞ ５⁃ＦＵ（38％ ）。

● 讨论

本研究选取三类人群中常见的肿瘤类型作为测试疾病对象，以临床上每类肿瘤对应的常规化疗药物作为测试的药物对象，以斑马鱼肿瘤异种移植模型作为检测的生物模型，目的在于评价斑马鱼肿瘤异种移植模型是否能够准确评价抗癌药物的药敏性。

本研究结果证实，在临床上效果显著的抗非小细胞肺癌药物、抗胃癌药物、抗肝癌药物，在斑马鱼肿瘤异种模型上同样能体现出其抑制癌细胞生长的效果，且明显具有剂量依赖效应。 本实验结果也表明，在斑马鱼肿瘤异种移植模型中，就抗肿瘤药物对特定肿瘤的治疗效果来看，各类抗肿瘤药物的抗肿瘤效果是有优劣之分的。

对于理化性质和作用机制各异的抗癌药物，本实验根据临床上的服用方式，相应地给予斑马鱼口服（水溶）给药或者静脉注射给药。结果证实，这些药物在斑马鱼体内不仅都体现出了良好的抗肿瘤效果，而且结果与临床用药基本一致。 这提示我们，斑马鱼肿瘤异种移植模型是一类可靠的、灵敏的、能够在体内测定药物抗癌效用的动物模型。

基于斑马鱼自身的物理特性优势及对抗肿瘤药物的药敏性，斑马鱼肿瘤异种移植模型是一类非常有应用前景的抗肿瘤动物模型，我们预测未来该模型将会在抗肿瘤药物的新药研发、老药再评价、药物联用组方筛选、耐药测试乃至人源的肿瘤移植⁃精准医疗中获得更加广泛的应用。