斑马鱼研究丨乳双歧杆菌BL-99或可改善斑马鱼肠道炎症和功能

近日，伊利集团与环特生物在国际期刊《Plos One》上联合发表题为 《Bifidobacterium lactis BL-99 modulatesintestinal inflammation and functions inzebrafish models 》的文章。（February 16, 2022）

在过去几十年里，糖的消耗量急剧增加。多项研究表明，糖的过度消耗与肠道通透性的改变和代谢疾病的发生密切相关。

乳双歧杆菌BL-99是伊利集团的专有菌株，已被商业化用于酸奶、冰淇凌、零食等产品。本研究旨在探讨伊利这种获得专利的、具有耐胃酸和耐肠液性能的益生菌乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)BL-99，在斑马鱼模型中对肠道炎症和功能的治疗作用和机制。

该研究基于斑马鱼实验表明，BL-99或可缓解由不规律高糖引发的肠道炎症，并改善肠道功能，为BL-99的功效潜力提供了新证据。

● 乳双歧杆菌BL-99

双歧杆菌是由法国学者初次分离出的一种厌氧革兰氏阳性杆菌，末端常常分叉，因此称为双歧杆菌。目前已经发现并测序几十种双歧杆菌，包括动物双歧杆菌 (B.animals)、长双歧杆菌(B.longum)和短双歧杆菌(B.breve)等。

双歧杆菌在人体肠道内是时刻变化的，婴幼儿时期，肠道内双歧杆菌较多，但随着年龄的增加，双歧杆菌逐渐减少。在整个生命历程中，肠道内的双歧杆菌维持着动态平衡，这对于肠道正常功能的发挥及人体健康是至关重要的。

乳双歧杆菌BL-99,是一株由内蒙古伊利有限责任公司自主研发的益生菌。分离自中国健康婴幼儿肠道，在中国科学院微生物所菌种保藏中心CGMCC进行专利寄存，保藏号为CGMCC156502-4。

乳双歧杆菌BL-99无抗生素耐受，无抗生素转移风险；毒理学评价表明BL-99无急毒、亚急毒特性，无体内转移风险，属于具有较高安全等级的益生菌菌株。乳双歧杆菌BL-99，已作为功能性食品成分用于伊利集团的各类产品，例如酸奶、营养补剂、冰淇淋等。

乳双歧杆菌BL-99，在改善肠道炎症、促进消化、调节免疫力、骨骼健康等方向得到了较好的科学验证。BL-99具有较好的耐酸能力、耐胆盐特性，可在肠道内保持活菌特性。

● 斑马鱼研究结果

斑马鱼（Danio rerio）的肠道成分与人类相似，如结缔组织、外纵肌和环形肌等。随着动物福利“3R原则（Reduction, Replacement, Refinement）”的实施，斑马鱼已被用作筛选肠道益生菌的替代模式生物。

研究发现，乳双歧杆菌BL-99能够在斑马鱼肠道中留存超过24h，促进肠道蠕动，有效缓解硫酸铝引起的便秘症状 ( p< 0.01)；

不规律高糖饮食，易诱发斑马鱼肠道功能和代谢紊乱；

为肠道功能和代谢紊乱的斑马鱼喂食乳双歧杆菌BL-99后，其IL-1β的基因表达显著下调，IL-10、IL-12基因水平显著上调（p < 0.05），肠道脂肪酶活性提高，但类胰蛋白酶未发生明显变化( p > 0.05)；

组织病理学与代谢组的分析表明，BL-99改善了斑马鱼肠道炎症，杯状细胞数量增加，其代谢物水平恢复；

BL-99或可通过调节斑马鱼的肠道和微生物代谢，来缓解肠道炎症和改善肠道功能。

● 实验结论

1. 斑马鱼幼鱼的研究

如图1A 和 1B 所示，在喂食BL-99后的2h、6h和24h，斑马鱼幼鱼肠道荧光强度分别为6.02±0.866、10.7±1.08和13.0±0.601像素。比较24小时和2小时的荧光强度，p < 0.001，但比较24小时和6小时的荧光强度时，p >0.05，表明乳双歧杆菌BL-99在喂食6小时后有效地保留在斑马鱼的肠道中。

图1. 斑马鱼肠道中的乳双歧杆菌BL-99保留和持续时间段对肠蠕动和便秘的治疗作用

如图2B和2C所示，正常斑马鱼肠道的荧光强度为403493±37456像素，硫酸铝处理斑马鱼肠道荧光强度为517757±11985像素（p < 0.01），说明斑马鱼便秘模型成功建立。

阳性对照药物多潘立酮能显著促进肠道蠕动，在用BL-99处理的斑马鱼润肠通便模型中，发现剂量依赖性，肠道荧光强度降低。

图 2 BL-99对斑马鱼肠道蠕动和便秘的作用效果。肠道荧光BL-99示意图，乳双歧杆菌BL-99 和斑马鱼的分析区域 (A)。斑马鱼肠道中的尼罗红荧光强度 (B) 和定量分析 (C)。

2. 成年斑马鱼的研究

2.1 炎症与免疫基因表达

提取的RNA (A260/A280) 的纯度在1.95-2.12范围内，如图3A所示，经3%的葡萄糖处理的斑马鱼显示出IL-1β基因表达的上升。经BL-99处理的斑马鱼模型中，观察到IL-1β基因表达的浓度依赖性下降，BL-99组较对比组下降。

图3.不规律高糖饮食诱导的成年斑马鱼肠道功能紊乱、肠道组织炎症、免疫基因表达及消化酶定量。斑马鱼肠道中的IL -1β基因水平 (A)、 IL-10基因水平 (B) 和IL-12基因水平 (C)。成年斑马鱼肠道中的脂肪酶活性 (D) 和胰蛋白酶含量 (E)。

如图3B所示，经3%的葡萄糖处理的斑马鱼显示出IL-10基因表达的下降。相对于模型组（图3C），BL-99在2.42*106、2.42*107和2.42*108 CFU/mL的浓度下，IL-10和IL-12的表达水平分别升高到3.96±0.219、1.27±0.150和1.85±0.176倍(p<0.001,p>0.05,p>0.05)和 1.01±0.097, 1.51±0.368和4.13±0.745倍(p>0.05,p<0.01,p<0.001)。

2.2 脂肪酶活性和胰蛋白酶含量

如图3D所示，经3%的葡萄糖处理的斑马鱼显示，肠脂肪酶活性降低。在用2.42*106、2.42*107和 2.42*108 CFU/mL的BL-99处理的斑马鱼模型中，可以观察到脂肪酶活性的浓度依赖性增加。BL-99处理的脂肪酶活性与对比组相比分别为16.4±1.10、18.2±1.15和31.8±2.58 U/g蛋白（p<0.05，p<0.01，p<0.001）。

尽管BL-99 显示出增加的趋势，但它对肠道胰蛋白酶含量没有统计学意义的影响，如图3E所示。

2.3 肠组织病理学

如图4A所示，H&E染色表明，正常斑马鱼的肠道具有较厚的肠壁、发达的肌肉层（a1，蓝色双头箭头）和肠绒毛。肠绒毛高度高、面积大、交错分枝或指状。正常肠杯状细胞（b，黑色单向箭头）数量众多，头部大而圆，在肠绒毛上皮细胞之间排列成行；淋巴细胞（c，黄色单向箭头）分布在细胞内的单层柱状上皮中（图4B）。模型组斑马鱼肠壁变薄（a2），绒毛稀疏且高度明显降低，肠腔扩张（d，黑色双箭头）；杯状细胞数量显着减少；淋巴细胞数量减少（图4C）。

与模型组相比，BL-99处理导致高绒毛发育，杯状细胞和柱状上皮细胞增多，肠道组织形态与正常斑马鱼非常相似（图4D）。

图4.用BL-99处理的斑马鱼肠道中，不规则高糖饮食引起的肠道功能障碍的组织病理学

3. 代谢特征

如图5所示，在正负离子模式下，正常对照组和模型组有明显的分离。正常斑马鱼与斑马鱼模型组相比，肠道内有106种正离子代谢物和218种负离子代谢物发生显著的统计学变化；213种正离子代谢物和402种负离子代谢物在模型斑马鱼和用BL-99处理的模型斑马鱼之间存在着显著的差异。

图5.肠道代谢谱的偏小二乘判别分析 (PLS-DA)。(A) 肠道功能障碍的斑马鱼模型组和正常组 (未治疗) 之间处于正离子模式和 (B) 处于负离子模式;  (C) 肠道功能障碍斑马鱼模型组和用BL-99处理的斑马鱼模型之间处于正离子模式和 (D) 处于负离子模式。

图6A显示了肠道功能障碍斑马鱼（模型）和正常（未处理）斑马鱼之间代谢物显著变化的热图，以及是否用BL-99处理的斑马鱼的热图。

图 6.显著变化的代谢物热图

● 讨论

在过去几十年里，糖的消耗量急剧增加，糖的过度消耗与肠道通透性和代谢疾病密切相关。

在本研究中，给斑马鱼喂食不规则的3%葡萄糖2周，肠道炎症因子IL-1β基因表达升高，肠道免疫因子降低，从而诱发肠道炎症和功能障碍。IL-10和IL-12基因水平降低、肠道脂肪酶活性降低、肠道组织学受损和肠道代谢组学紊乱。在乳双歧杆菌BL-99处理后，斑马鱼肠道炎症得到缓解，肠道免疫反应增强，肠道黏液屏障和组织病理学得到改善。

值得一提的是，在3%葡萄糖诱导的斑马鱼肠道功能障碍模型中观察到肠道代谢障碍，包括肠道细胞和肠道微生物群代谢。例如，发现了6种肠道细胞功能相关代谢物（瓜氨酸、甘油、CDP-乙醇胺、葡萄糖酸内酯、尿苷和尿嘧啶）和5种肠道微生物群相关代谢物（牛磺酸、中康酸、脲基琥珀酸、乳清酸和 4-羟基苯甲醛）。这11种代谢物，加上2种有机化合物双-γ-谷氨酰胱氨酸和 R-硫辛酸，在经3%葡萄糖喂食过的斑马鱼肠道中均显著增加。

令人惊讶的是，经乳双歧杆菌BL-99处理，这些肠道和微生物群代谢物恢复到与正常对照斑马鱼相似或接近的水平。

这些结果表明，乳双歧杆菌BL-99或可缓解由不规律高糖引发的肠道炎症，并改善肠道功能（图7）。但是，未来仍需进一步开展人体试验，以进一步确认该菌株在人体中的功效。

图7. BL-99 调节肠道炎症与功能的可能机制