斑马鱼模型在白血病研究中的应用｜斑马鱼模型研究

急性淋巴细胞白血病(ALL)起源于骨髓中的T淋巴细胞和B淋巴细胞，是儿童常见的癌症。目前，通过包含化疗的典型治疗和高危或复发病例的异基因骨髓移植治疗，这些儿童的5年生存率超过90%。虽然这些患者的存活率很高，但目前的治疗有许多长期的有害副作用。由于这些原因，目前的工作重点是降低治疗毒性，并为高风险患者和复发疾病患者开发有针对性的治疗方法。

1、急性T淋巴细胞白血病:

急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）占儿童急性淋巴细胞白血病的15%。T-ALL 在胸腺形成，来源于已经获得遗传或表观遗传变化并迁移到骨髓、外周血和淋巴结的未成熟胸腺细胞。

T-ALL患者的基因改变包括易位、基因融合、染色体获得和缺失以及表观遗传异常。儿童和成年T-ALL患者均在NOTCH，PI3K–AKT，JAK–STAT和RAS通路中表现出频繁的突变，不像大多数其他儿科癌症在突变上与成人癌症明显不同。早期的斑马鱼T-ALL模型总结了小鼠和人类研究，并快速的发现了此疾病的肿瘤进展与存活的新机制。

2、Myc驱动的T-ALL斑马鱼模型:

转基因斑马鱼肿瘤模型是应用rag2启动子驱动小鼠原癌基因Myc在T和B淋巴细胞中的表达的T-ALL模型。在Tg(rag2:mMyc)转基因模型中，Myc嵌合体表达诱导6%的动物出现T-ALL，平均潜伏期为44天。

由Myc驱动的T-ALL条件种系斑马鱼模型现已通过以下三种方法之一建立：

(i)将Cre mRNA注射到Tg(rag2-lox-dsRED-lox-EGFP-mMyc)斑马鱼胚胎；

(ii)让Tg(rag2:LDL-EGFP-mMyc) 和Tg(hsp70:Cre) 品系斑马鱼杂交；

(iii)用4-羟基他莫昔芬处理Tg(rag2:hMYC-ER)品系斑马鱼。

正如后面详述的，在这些精准模型中重现性和肿瘤分生率的提升（到生命第35天，肿瘤发生率达80%-100%），使得促进或抑制Myc-驱动T-ALL发病，发展和生存的新基因和/或遗传途径，以及可抑制体内肿瘤发生的药物的发现成为可能。

3、Notch驱动的T-ALL斑马鱼模型:

在超过60％的T-ALL病例中，NOTCH信号通路被异常激活，并能通过MYC依赖和非依赖通路促进T-ALL肿瘤的发生。

此外，NOTCH1和Myc在斑马鱼T-ALL发病过程中协同工作，因为与单独Myc或NICD的表达相比，rag2介导的Myc和NOTCH1的组成型活性细胞内结构域（NICD）的表达加快了T-ALL的进程。

增强的Notch信号传导不会增加白血病增殖细胞的数量，这表明NOTCH控制着癌前细胞的扩增，而Myc主要驱动克隆细胞的生长和存活。在约16％的复发性儿科T-ALL病例中，Notch通路突变也与Hedgehog通路的激活有关。ptch1（Hedgehog信号通路的负调节因子）的丢失加速了斑马鱼中notch1诱导的T-ALL的发作，这表明Hedgehog信号通路的激活与NOTCH1协同驱动T细胞转化。

4、确定T-ALL肿瘤发生的新遗传机制:

斑马鱼已被用于发现通过不同机制驱动T-ALL发病机理的新致癌辅因子。例如，发现胸腺选择HMG蛋白（TOX）与Myc以及NICD协同作用，通过受损的非同源末端连接DNA修复诱导基因组不稳定，从而促进斑马鱼的T-ALL进展。

ARID家族基因的表达升高会导致T-ALL肿瘤的myc水平升高，这表明ARID5B有助于T-ALL肿瘤发生过程中Myc的过表达。JDP2编码bZIP蛋白，其异常的淋巴细胞特异性表达与小儿T-ALL病例的整体生存期差有关，足以诱发超过50％的斑马鱼在受精后40周（wpf）患上T-ALL，并且与Myc共表达时能引起更高的肿瘤风险。因此，这些研究揭示了有可能靶向地使MYC驱动的T-ALL肿瘤失效的新机制的存在。

5、使用斑马鱼确定T-ALL的新疗法:

小儿白血病患者有>90％的存活机率。然而，当前的治疗方案会引起全身毒性，并且一部分患者会复发。

为了确定可能解决该问题的新型T-ALL治疗方法，使用T-ALL模型Tg（rag2：MYC-ER）品系斑马鱼对4880种FDA批准的化合物进行了小分子筛选。

斑马鱼胚胎实验发现，吩噻嗪类抗精神病药奋乃静可降低胸腺荧光，减轻MYC诱导的T-ALL斑马鱼的肿瘤总负荷，以及抑制鼠异种移植模型中人T-ALL细胞的生长。

在Myc; Akt驱动的T-ALL中，糖皮质激素地塞米松和AKT抑制剂（MK2206）的组合对抑制白血病增殖细胞非常有效。使用连续移植的方式，发现MK2206克服了地塞米松的耐药性，这一发现在人T-ALL细胞中得到了重现。MK2206进入了儿童难治性恶性肿瘤的I期临床试验，并且在测试剂量下耐受性良好，但迄今为止仅观察到有限的获益。

在斑马鱼Myc驱动的T-ALL模型中，发现jdp2的表达赋予地塞米松耐药性。斑马鱼数据表明，对AKT途径活化和/或JDP2升高的患者分层可能有助于预测对涉及糖皮质激素治疗的反应。

6、急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）:

B-ALL占所有儿童期ALL病例的85％。B-ALL和T-ALL在形态上是无法区分的，两种疾病的特征在于拥有不同的分子亚型。

尽管频率不同，成人和小儿B-ALL均存在相似的遗传和染色体异常，包括BCR-ABL1和ETV6-RUNX等融合基因，MLL重排，超倍性和亚倍性。

斑马鱼中的B-ALL模型使用非洲爪蟾伸长因子1α和斑马鱼β-肌动蛋白启动子普遍表达TEL-AML1（ETV6-RUNX），以诱导3％的B-ALL肿瘤发生率。

此外发现，Tg（rag2：hMYC）品系的一部分斑马鱼也患有B-ALL肿瘤，具有与T-ALL肿瘤不同的基因表达谱，表明该转基因品系实际上是混合型急性淋巴细胞白血病模型。这些研究强调需要结合现代比较肿瘤基因组学方法来验证正在建模的斑马鱼品系对应的人类肿瘤的确切类型和/或亚型。

7、急性髓系白血病（AML）斑马鱼模型:

AML的定义是，未成熟的骨髓细胞占据患者至少20％的骨髓。AML的整体5年生存率是64％，但不同分子亚型的患者，其生存率差异显著。

与其他恶性液体肿瘤不同，一些儿童AML患者的体细胞变异与成人AML中观察到的显著不同。儿童AML以AML1-ETO（也称为RUNX1-RUNX1T1），NUP98-NSD1和KMT2A-MLLT3等基因融合事件为唯一特征。

hsp70启动子驱动的AML1-ETO的表达，CMV启动子驱动的FLT3-ITD或FLT3-TKD的表达，导致早期斑马鱼胚胎中的髓样细胞扩增。使用COX2抑制剂尼美舒利阻止β-连环蛋白介导的骨髓生成，可以逆转AML1-ETO胚胎的造血缺陷。

此外，通过使用酪氨酸激酶抑制剂（AC220）可以消除FLT3-ITD动物的髓样扩增，而FLT3-TKD动物则不能，这表明看似相似的遗传异常存在不同的治疗机率。这些研究说明了斑马鱼胚胎在了解造血过程中致癌融合基因的基本机制以及发现小儿白血病新疗法方面的实用性。